PCR-pcr-英瀚斯生物科技

分子与质粒载体构建

实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，pcr，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，基因检测多少钱，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

18.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5"端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C 左右。

有用的荧光染料参数

动物组织细胞基因组DNA提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ，10min。

6.小心倒掉上清液，实时定量pcr，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，PCR， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

PCR-pcr-英瀚斯生物科技由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司实力不俗，信誉**，在江苏 南京 的技术合作等行业积累了大批忠诚的客户。英瀚斯带着精益求精的工作态度和不断的完善**理念和您携手步入辉煌，共创美好未来！

南京英瀚斯生物科技有限公司的团队实体组建于2013年，前期以“东较生物”运营医学科研外包业务，是南京国有资产监委会参股的，专注于医学科研外包服务的地区**企业。根据团队发展需要，医学科研外包业务自2020年以“英瀚斯”**独立运营。“英瀚斯”为Enhancer音译，寓意“英瀚斯”能像Enhancer在基因表达中起到增强作用一样，促进客户的科研进程，提高实验效率，让客户的科研idea*付诸实施，真正做到“思考留给科学，实验外包出去”！ 公司总部位于南京，在济南、西安、昆明、福州、合肥、乌鲁木齐、银川等地设有办事处，并于2015年在东南大学地区大学科技园内建设有完善的实验研发平台，包括标准动物实验室、细胞学实验室、分子生物学实验室和病理学检测实验室；公司已经通过了ISO9001质量管理体系认证，拥有技术平台，包括：动物实验平台、分子生物学平台、细胞生物学平台、组织病理学平台以及电生理检测等平台，可以为制药公司、医院、科研单位等科研工作者提供整体科研解决方案和医学科研服务。 公司目前拥有多项专li产品及技术，其中发明专li两项，软件著作权八项，实用新型专里三项，商标两件。公司先后获得“江苏省民营科技企业”、“江苏省科技型中小企业”、“江苏省专精特新中小企业”等荣誉资质，连续多年被评为“东南大学地区大学科技园企业”。2019年公司成为江苏省生物技术协会*七届理事会的特邀理事，成立了“李冬冬**工作室”，并获得了南京市“工人成员号”的荣誉称号。 英瀚斯（东较）生物始终以“信誉**，合作共赢”为发展原则提供高质量的医学科研外包服务，我们已经与来自各地几百家医院、企业及科研院所建立了长期的合作关系。南京英瀚斯，医学科研的增强子！合作只是起点，服务没有终点！我们致力于做**的医学科研外包服务商。