• 武汉腺病毒载体-武汉友名生物

    武汉腺病毒载体-武汉友名生物

  • 2021-05-06 13:39 47
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    基因表达产物通常是蛋白质,但是非蛋白质编码基因如转移RNA(tRNA)或小核RNA(snRNA)基因的表达产物是功能性RNA。

    所有已知的生命,腺病毒载体,无论是真核生物(包括多细胞生物)、原核生物(细菌和古细菌)或病毒,都利用基因表达来合成生命的大分子。基因表达可以通过对其中的几个步骤,包括转录,RNA剪接,翻译和翻译后修饰,进行调控来实现对基因表达的调控。基因调控赋予细胞对结构和功能的控制,基因调控是细胞分化、形态发生以及任何生物的多功能性和适应性的基础。基因调控也可以作为进化改变的底物,因为控制基因表达的时间、位置和量可以对基因在细胞或多细胞生物中的功能(作用)产生深远的影响。在遗传学中,基因表达是基因型产生表型的基本水平。存储在DNA中的遗传密码通过基因表达得到“翻译”,并且基因表达的特性产生生物体的表型。因此,基因表达的调节对于生物体的发育至关重要。


    位点特异性重组法

    这类方法使用来源于噬菌体的重组酶,这类重组酶能够识别特异性序列位点(长度数十碱基对至数百碱基对)并引发含有该位点的序列之间的重组;在腺病毒骨架和穿梭质粒中添加重组酶能够识别的特异性位点,在细胞内表达对应的噬菌体重组酶或体外使用重组酶,介导骨架质粒和穿梭质粒之间的位点特异性重组,将目的基因引入骨架质粒,形成带有重组腺病毒基因组的腺病毒质粒;转染包装细胞,进行病毒载体拯救。该方法进一步简化了腺病毒质粒的制备过程,它的缺限是在腺病毒基因组的某些部位不可避免的残留了重组酶特异性识别位点。


    腺病毒载体的构建经历了体外直接连接、包装细胞内重组、细菌内重组、位点特异性重组4个发展阶段,同时随着分子生物学技术的发展,改进的体外连接法又得到应用。

    体外连接法。这种方法需要全长腺病毒基因组和一个含腺病毒基因组左末端序列的质粒,包括左端反向末端重复(Inverted terminal repeat,ITR)、包装信号和E1A的增强子序列。将目的基因克1隆到质粒的病毒序列下游,ClaI酶切获得含目的基因的基因组左末端,连接到ClaI酶解的野1生型腺病毒基因组(ClaI在病毒基因组仅有一个酶切位点,位于E1A基因内部),将得到的含目的基因的的基因组DNA直接转染包装细胞293,产生重组病毒颗粒。这种方法需要培养野1生型腺病毒以提取病毒基因组,能够使用的酶切位点仅有一个,连接效率低,而且仅删除了部分E1A基因,外源基因载量有限,所以现已淘汰不用。


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