FFPE样本DNA提取试剂盒,不会引入由于提取环节的不标准而导致的实验偏差。适用多种组织样本,采用纳米磁珠和特制的缓冲液系统,可从FFPE样品中提取高质量的基因组DNA。
FFPE样本DNA提取试剂盒使用中为什么要脱蜡?
如果要对FFPE组织进行分子生物学研究,开始的就是要进行DNA的提取。 但是固定剂的交联作用对核酸是有害的,福尔马林石蜡和交联作用会妨碍核酸的提取,抑制DNA聚合酶的活性从而影响PCR扩增。除此之外,石蜡阻碍消化液对组织的渗透,从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触,影响组织消化和DNA释放。所以为了消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响,必须在保证不增加外源性PCR抑制因子,并尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底脱蜡。
FFPE样本DNA提取试剂盒中常用的法脱蜡法的过程和问题:
目前应用在成熟试剂盒中的脱蜡方法主要是溶剂脱蜡法,其中脱蜡法由于其脱蜡彻底的特性,较广泛的应用在疾病研究中。
在脱蜡法中,需要将石蜡包埋组织浸泡在溶液中进行脱蜡,后面经过两次高温处理,每次各一个小时,分别在56℃和90℃。在此期间结合消化缓冲液和蛋白酶K来消化组织,同时利用梯度乙醇来疏松组织结构、促进消化液渗入并去除组织中痕量。
FFPE样本DNA提取试剂盒的应用步骤:
1、从源头抓起,完善样本的前处理
离体时间:取材后应在30min内及时固定,防止组织变质。
样本要求:选择合适大小的组织块制作石蜡包埋组织样本,一般不**过15x10x5mm。
固定液选择:建议使用10%中性福尔马林固定液,对组织进行固定,固定液应为被固定标本体积的5-10倍,并定期更换。
固定时间:根据样本情况调节固定时间,一般在24-48h为宜,固定时间过长会加重FFPEDNA的片段化。
包埋要求:选用纯净且熔点适宜的蜡,包埋要迅速,禁用明火。
切片厚度:包埋好的组织样本根据需要确定切片厚度,标准切片厚度为4um,用于核酸提取的切片可以在10-20um,保证切片厚度的持续稳定。
2、选择合适的提取试剂盒
目前市场上有多种提取试剂盒,应选择合适的试剂盒才能保证实验的成功率。
FFPE样本DNA提取试剂盒提供了一种简单、快速的从石蜡包埋组织、石蜡切片组织和石蜡固定样本中提取基因组DNA的方法。石蜡组织经脱蜡处理后,配合裂解试剂释放组织中的DNA,再通过快速磁响应结合到磁珠表面,获取高度纯化的基因组DNA,可直接用于PCR、qPCR、文库构建等多种下游实验。
产品优势:
1、提取率高;
2、QPCR结果Ct值较小;
3、提取产物可用于后续PCR、QPCR分析。
FFPE样本DNA提取试剂盒的常见问题分析及解决方法:
从前处理、提取、建库到测序分析,FFPE样本常见问题复杂多样,其中绝大部分问题和样本直接相关,可以通过回溯实验过程及分析来优化实验。
1、文库复杂度低
原因:样本质量差:测序深度太高;
优化方法:规范前处理、核酸提取过程;检查设备状态等;调整测序深度。
2、文库片段短
原因:样本质量差;打断时间过长
优化方法:规范前处理;调整打断时间。
3、文库总量低
原因:核酸投入/杂交投入量低;样本质量差;实验操作不规范;
优化方法:投入足够量的核酸,规范实验操作。
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