如果血浆病原DNA提取试剂盒中提取的DNA溶液OD260/OD280比值小于1.6,通常说明有蛋白质或酚、多糖等的污染;如果提取的DNA溶液OD260/OD280>1.9,则表明有RNA污染。
一般来说,血清血浆的量与提取的核酸量成正比。因而,如果要提高核酸得率,可通过增加血清或血浆的量来实现。一般地,做血浆或血清核酸提取,样本量在1ml以上。如果1ml或较大量样本得不到满意的检测结果,则应及时考虑更换提取试剂盒。血浆病原DNA提取试剂盒的核酸提**率较高,1ml病人血浆样本DNA得率在85ng左右,Q的得率在72ng左右,T的得率在63ng左右,基本上都能满足下游PCR实验的需求。其检测下限为2ng/ul。如洗脱液为30ul,则需要1ml左右的血浆才能检测出来。显然,如果是健康人的血浆,1ml血浆的DNA浓度较低。因而,血浆DNA提取完成以后,应该直接做PCR。
实验室工作中,经常会需要用到纯化的DNA,这时我们通常需要使用一个商业的DNA提取试剂盒对目的DNA进行分离纯化。市面上有很多类型的提取试剂盒,当使用不太熟悉的样本类型时,选择合适的盒子是尤为关键的。
目前大多数DNA提取试剂盒遵循相同的基本步骤:裂解、柱纯化、洗涤杂质、柱洗脱。然而,不同的盒子在完成每个步骤的方式上有很大的不同。
血浆病原DNA提取试剂盒的操作步骤:
1、取出洗涤液,按以下操作:
洗涤液A:21mL加入9mL无水乙醇;42mL加入18mL无水乙醇,混匀。
洗涤液B:9mL加入21mL无水乙醇;18mL加入42mL无水乙醇,混匀。
配制好的洗涤液如出现沉淀,可在37℃溶解,摇匀后使用。
2、取1.5mL离心管,加入200μL血液样本,再加入200μL 裂解液及40μL 消化液,振荡混匀,65℃水浴10 分钟。
3、加入150μL异丙醇(总体积的25%),混合均匀,如有半透明悬浮物,不影响DNA的提取与后续实验。
4、将吸附柱放入收集管内,将上述溶液转入吸附柱内,12,000 rpm 离心1 分钟,弃收集管内废液;
5、将吸附柱放回收集管内,加500μL 洗涤液A至吸附柱内,12,000 rpm 离心1 分钟,弃收集管内废液。
6、将吸附柱放回收集管内,加500μL 洗涤液B至吸附柱内,12,000 rpm 离心1 分钟,弃收集管内废液。
7、按每份样本40μL 取洗脱液,放置于灭菌1.5mL离心管,65℃预热。
8、将吸附柱放回收集管内,12,000 rpm 离心2 分钟,离去残留的洗涤液。
9、取出吸附柱,放入新的1.5 mL 灭菌离心管内,在吸附柱中心加入40 μL 预热洗脱液,静置2分钟,12,000 rpm 离心1分钟,收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
选择血浆病原DNA提取试剂盒也取决于你需要多少DNA?
大多数DNA分离试剂盒公司都提供含有类似成分的试剂盒,这种试剂盒可以根据处理样品的体积进行缩放。对于特别的应用,当涉及到培养物或组织样本的数量时,选择可能较少。
小量制备:>15 mL
中量提取:15-25 mL
大规模制备:100-200 mL
巨型制备:500-2,500 mL
甚**达2.5-5升。
一般来说,质粒DNA分离要比基因组DNA分离温和。这是因为针对质粒DNA的裂解步骤需要染色体DNA与细胞蛋白片段保持结合,以防止其污染终的样品。两种类型的DNA回收都有试剂盒,甚至有可以同时纯化基因组DNA和总RNA的试剂盒。
当使用血浆病原DNA提取试剂盒分离不同血液体积样本时,能表现得较好,在于提取较高的DNA产量和纯度。
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