原代细胞培养的培养及传代

原代细胞的培养步骤

一、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养要求

1、细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性；

2、细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L；

3、培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养；

4、小牛血清浓度为10%-80%；

5、应在37℃5% CO2的培养箱中培养；

6、在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮；

7、待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液；

8、用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。

二、悬浮细胞的培养要求

1、原代培养时要尽量去除红细胞；

2、短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行；

3、细胞浓度可在5-8×109/L范围内进行分瓶试验；

4、长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长；

5、细胞换液一般每隔3天需半量换液一次；

6、细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。

三、原代细胞的维持

1、贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来较新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要；

2、换入等量*培养基或换成含2%小牛血清的维持液；

3、悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法；

四、原代细胞培养的传代

原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度；贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。

传代应注意以下几点：

(1)细胞生长密度不高时，不能急于传代。

(2)原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。

(3)吹打已消化的细胞应减少机械损伤。

(4)传代时细胞接种数量要多一些。

(5)传代培养的pH应偏低些。小牛血清浓度可加大至15%～20%左右。