友名生物公司-分子量marker

植物ＤＮＡ的“一管法”提取方法：1 称取100ｍｇ新鲜植物组织，剪碎置于1 5ｍｌ离心管中，可加入少许无菌石英砂，加入3滴提取缓冲液，用带玻璃钻头的电钻充分研磨匀浆。2 加入400μｌ提取缓冲液，混匀后置于90℃水浴中，不时颠倒摇匀。3 温育20ｍｉｎ后，置于冰浴中5ｍｉｎ，使组织和聚乙烯聚吡咯烷酮(ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＰＶＰＰ)沉淀，置于4℃下保存备用。

回收产物的检测

1.紫外分光光度计法检测DNA在OD260处有明显吸收峰，当OD260=1时，相当于大约50 ng/μL双链DNA、40 ng/μL单链DNA。OD260/OD280≈1.6~1.9时，说明DNA纯度较高。若洗脱时不用洗脱缓冲液，而是用去离子水，会使比值偏低，因为离子的存在会影响吸光度。但不表示纯度低。

2.SYBR法检测取回收产物1 μL，分子量marker，与1 μL SYBR染料混匀，于荧光透1视仪下观察是否有黄绿色荧光。

3.琼脂糖凝胶电泳法检测取回收产物5 μL，与10×Loading Buffer混匀，DNA Marker加5 μL，电泳后凝胶成像观察。5 μL DNA Marker相当于每个条带50 ng DNA，观察目的条带亮度大致为Marker的两倍，则大致估算其浓度约为20 ng/μL。

在选用支原体PCR法检测来替代药典方法时，需要考虑如下两个方面：

首先一步是要使用符合欧洲药典要求，经过全方面验证的支原体检测试剂盒，第二部是自我验证，即确认所用的样本基质对于该试剂盒方法是合适的，并且操作过程是正确的。小规模的室内验证通常需要采用三个不同批次的试剂盒，然后加入10CFU的标准品，做复孔（通常是8个复孔），并且至少选择3个支原体物种进行验证。

有的支原体标准品厂家会提供CFU与基因拷贝数的比值，以方便二者的换算。因为10CFU只能确定PCR能够达到的检测限在10CFU以下，但无法具体确定灵敏度的数值。带DNA拷贝数标定的基因组DNA标准品则可进一步确定检测限的数值。

总之，PCR方法很有用，但需要避免假阴性，验证时应使用阳性对照、阴性对照、无模板对照和内控对照，以保证PCR反应正常，以及支原体少量存在时确实能检出来，支原体不存在时也确保是结果阴性，从而使得PCR方法在工业应用时能确保zui终结果的可靠。

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