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1、密度梯度离心法
密度梯度离心法包括速度区带和等密度离心二种方法。后者又可分为预制梯度等密度及自形成梯度等密度两种方法，现分别叙述如下：

2. 按温度分类：分为常温离心机和冷冻离心机
常温离心机：未装置制冷机组，机器运行后，机舱内温度**室温。
冷冻离心机：装有制冷机组，机器运行后，机舱内温度可控制在室温以下。
1、离心分离的原理
将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为“颗粒”。每个颗粒都有一定大小、形状、密度和质量。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。颗粒除受到离心力(Fc)外，还受到颗粒在介质中移动时的摩擦阻力(Ff)、与离心力方向相反的浮力(FB)、颗粒处于重力场之下的重力(Fg)和与重力方向相反的浮力(Fb)。各力的作用方向见图4—1。此外，颗粒还受到周围介质小分子的作用力，当颗粒很小时，介质分子对颗粒的作用力十分明显，要使这种小颗粒沉降，需要较大的离心力。本节只讨论比介质分子大得多的颗粒，因此介质作用力不予考虑。
3. 连续流离心转子：
主要用于悬浮介质中高速分离较小的颗粒物质，如在培养基中分离细胞，在运转过程中，悬浮样品以一定速度从转子体中心流入离心池，由于溶液中的组分轻重不同，在离心力场作用下，重粒子具有较大的惯性离心力、沉降快，当流速增大（降低）到一定值时，重粒子将留在离心池外缘底部，而介质将从出口流出并带走较轻的粒子，收集组分的方法是把组分冲洗出离心池或者留在转子体内，这种转子是利用离心淘析技术对整细胞或大的亚细胞粒子进行分离，在无菌和低温条件下，被分离的组分，能保持活性，回收率高等优点。如果液流方向与离心力方向相反，即降低了粒子运行速度，相当于增长了运行距离，从而提高了分辨能力。

二．转子分类
转子是离心机的**部件，转子一般可分为下列三大类：
1. 固定角转子（俗称角转子）：
主要用于分离沉降速度有明显差异的颗粒样品。颗粒在扇形溶地移动的距离很短，碰到外壁的颗粒沿着管壁滑到管底，形成沉淀，因此这种转子能很快地收集沉淀物。
1）离心力
离心力(Fc)的大小等于离心加速度ω2R与颗粒质量m的乘积，即：
Fc＝mω2R　　　　(4–1)
其中ω是旋转角速度（弧度/秒）,R是颗粒离旋转中心的距离（cm），m是质量（克）。

4）浮力
在重力场中，浮力的定义是指被物体所排开周围介质的重量。但在离心场的情况下，颗粒的浮力与离心力方向相反，为颗粒排开介质的质量与离心加速度之乘积。用下式表示：
FB＝Pm(m/Pp)ω2R＝Pm/Ppmω2R （4–5）
其中Pp为颗粒密度(g/cm3)，Pm为介质密度(g/cm3)，m/Pp为介质的体积，Pm (m/Pp)为颗粒排开介质的质量。
综上所述，在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、浮力FB和摩擦阻力Ff。当离心转子从静止状态加速旋转时，原来处于悬浮状态的颗粒如果密度大于周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向移动，即发生沉降；如果颗粒密度**周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动，即发生漂浮。无论沉降或漂浮，离心力的方向与摩擦阻力和浮力方向相反；当离心力增大时，反向的两个力也增大，到后离心力与摩擦阻力和浮力平衡，颗粒的沉降(或漂浮速度)达到某一极限速度，这时颗粒运动的加速度等于零，速度dx/dt变成恒速运动。那么
Fc＝FB＋Ff （4–6）
将式4–1，4–3，4–5代入式4–6得
mω2R＝6πηrpdR/dt＋(Pm/Pp)mω2R （4–7）
其中球形体积V为4πrp3/3，m＝VPp＝(4πr3p/3)Pp故4–7式可写成：
(4πrp3/3)(Pp)(ω2R)＝6πηrpdR/dt＋(4πr3/3)(Pp)(ω2R)
整理后得：
dR/dt＝4rp2 (Pp－Pm)/18ηω2R （4–8）
或者：
V＝dR/dt＝d2(Pp－Pm)18ηω2R （4–9）
上式d为颗粒直径(厘米)，对于非球形颗粒还应考虑f/f0的摩擦系数比，得：
dR/dt＝d2(Pp－Pm)/(18ηf/f0)ω2R （4–10）
从式4–10可见：①颗粒的沉降速度与颗粒直径的平方、颗粒与介质的密度差和离心加速度成正比，而与介质的粘滞度、颗粒偏离球形的程度成反比；②当颗粒的密度Pp大于介质密度Pm颗粒发生沉降；当Pp＜Pm时，颗粒漂浮；当Pp＝Pm时，颗粒不沉不浮；③在离心加速度ω2R不变的情况下，颗粒的沉降速度主要决定于颗粒的直径大小和颗粒的形状，而颗粒的密度所起的作用较小。

2）等密度离心法
某些密度梯度介质经过离心后会自身形成梯度，如Percoll则可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘苯甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底部浓而管**稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度即ρm＞ρp时，颗粒上浮；当管**介质的密度小于颗粒的密度即ρp＞ρm时，则颗粒沉降；后颗粒进入到一个它本身的密度位置即ρp＝ρm，颗粒不再移动，形成稳定的区带。等密度离心法需时间较长，一般为十几小时至几十小时。
梯度材料的选择原则 ①对被分离的生物样品无作用，不会使生物样品失活；②在溶液中稳定，在离心作用下不会解离或聚合；③在使用的密度范围中，粘度低，渗透压小，离子强度及pH值变化小；④易与被分离的颗粒分开；⑤不会对离心机设备发生腐蚀作用；⑥便于浓度测定等等。这些原则当然比较理想，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：
(1)糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖(ficoll)、右旋糖酐、糖原等。
(2)无机盐类：CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等。
(3)**碘化物：三磺苯甲酰葡萄糖胺(martizamide)等。
(4)硅溶胶：Ludox的各种类型，如Percoll。
梯度液的收集 离心后颗粒在梯度液中分层，小心取出离心管，防止振摇以避免分层的
颗粒混和。收集梯度液中颗粒的方法很多，有管底穿孔计滴法、插管虹吸计滴法，浓液**替法和注射器穿孔抽取法等。

1、差速离心法
差速离心法是指通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心方法。差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。
进行差速离心时，首先要选择好颗粒沉降所需要的离心力和离心时间。离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤。当一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到和重颗粒的沉淀，分出的上清液进一步加大转速再次进行离心，又得到*二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含较小较轻颗粒的“上清液”。如此多次离心处理，即能把流体中的不同颗粒较好地分离开，此法所得沉淀是不均一的，仍杂有其它成份，需经再悬浮和再离心(2~3次)，才能得到较纯的颗粒。
差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子；缺点是：(1)分离效果差，不能一次得到纯颗粒。(2)管壁效应严重。特别当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀。(3)颗粒被挤压，离心力过大，离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种颗粒不容易分开，它常用于其他分离手段之前的粗制品提取。各种颗粒的沉降速度遵循式4—10。颗粒愈大，沉降速度也愈大，离心后沉淀到离心和底部所需的时间愈短。
二、根据分离工作量和研究需要进行选择：
1.一般进行研究和小批量制备时多选用台式离心机；
2.进行大批量制备时多选用大型落地式离心机；

问题1：实验室离心机的摆放应该注意什么?
答：离心机一般放在干燥、避免阳光直射的地方。离心机散热量比较大，周围不要堆放杂物，四周离墙壁、挡板等不透气、散热性差的物品至少10cm以上。同时，离心机尽量单独放在一个房间，周围不要放**试剂、易燃品。

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