杭州过滤器鼻病毒中心 病毒灭活试验 微生物研究所

一个理想的灭活剂必须对病毒核酸(它具有感染性)有的灭活作用而对其衣壳或蛋白外膜(它具有*原性)没有作用。当然，不属于这个范畴，因为它既可通过交联使蛋白质变性，又可与核苷酸的氨基作用。乙型丙内酯或氧化精胺可能是这类灭活剂的候选者。以核酸为靶子的灭活剂(如羟胺)的—个主要问题是可能诱导突变株，除非每一个核酸分子都被灭活剂击中几次或者灭活剂的作用不能产生突变株。在若干种病毒中已知紫外线能产生复数复原作用，因此不能用紫外线照射作为灭活剂。
病毒灭活的机理有三:
1、破坏包膜：包膜含有脂类物质，因之有包膜的病毒可迅速被脂溶剂破坏，如、氯仿或去氧胆酸钠可使病毒灭活。实际上可利用病毒对脂溶剂的敏感性来检查病毒是否有包膜。物理因子，如渗透压改变、冻融、热和干燥等都可引起包膜破坏。一般认为，呼吸道感染的病毒对于燥抵抗力弱，传播主要是人间直接感染，这是因为有包膜的原故。
2、病毒蛋白质变性：能使蛋白质变性的化学制剂都能使病毒灭活，如酚、、次氯化物、酸和碱等。加热引起变性也是有效灭活的方法。一般说病毒对热抵抗力弱，60°C几分钟就使之感染性明显降低，因此在分离病毒时，从患者取来的标本需低温保存，迅速送往实验室，长期保存置于-80°C以下的低温条件。
3、病毒核酸的损害：、y线等电离可切断核酸，紫外线可使核苷酸链上相邻的嘧啶碱基形成二聚物，而破坏病毒基因的功能。另外吖啶橙或中性红等染料可与病毒核酸结合，暴露于光线之下，可使核酸分解，而使病莓灭活。

病毒灭活滴度计算方法：终点稀释法病毒感染滴度的计算以半数细胞感染剂量(TCID5o) 表示。TCID5o 的对数值计算公式如下。
TCID5o对数值=病变率**50%组稀释度的对数值+距离比例(“病变率**50%组”是指病变率**过50%的组,下简称“**50% 组”;“病变率**50%组”是指病变率**50%的组，下简称“**50%组”)。

病毒灭活试验病毒悬液的制备：
1、从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37°C温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀,立即离心(3000r/min， 3min) ，去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
2、取出低温冻存的试验病毒毒种，37°C水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37°C温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
3、将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波(或反复冻融)破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心(6000r/min,15min)去除沉淀(主要为细胞碎片)，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1. 0分装于无菌离心管(1.5)中。
4、取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80°C备用。

病毒灭活试验器材：
1、试验用病毒株:脊髓灰质炎病毒1型(poliovirus- I，PV- I )；疫苗株;艾滋病病毒1型(HIV-1)美国株。
2、宿主细胞:可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL、细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T淋巴细胞白血病病毒1型(human T cell leukemiavirus 1, HTLV-1)基因的人淋巴细胞(株)作为HIV-1的测试细胞。
3、细胞培养瓶与96孔培养板。
4、恒温水浴箱。
5、二氧化碳培养箱。
6、层流**净工作台。
7、低温冰箱(-20°C， -80°C)。
8、液氮罐。
9、倒置显微镜。
10、离心机。
11、可调移液器及配套一 次性塑料吸头。
12、细胞维持培养基。
13、细胞完全培养基。
14、去离子水。
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